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    小鼠谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)試劑盒使用說明書

    發(fā)布時間: 2024/10/16  點擊次數(shù): 146次
    提 供 商: 研域(上海)化學(xué)試劑有限公司 資料大?。?/td>
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    小鼠谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)試劑盒

    本試劑盒僅供體外研究使用,不用于臨床診斷

    本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中小鼠谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)的含量。

    有效期:6個月

    保存條件:2-8℃

    試劑盒組成:

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    備注:

    1.(96T/48T)打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全。

    2. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為:800、400、200、100、50、25 pg/mL

    3. 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗,標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過標(biāo)準(zhǔn)品濃度時,可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實驗。

    檢測前準(zhǔn)備工作:

    1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。

    2. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正?,F(xiàn)象;放置室溫,輕搖均勻,待結(jié)晶溶解后再配置洗滌液??蓪?0ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液,未用完的放回4℃

    3. 20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

    實驗原理:

    小鼠谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預(yù)先包被小鼠谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。

    實驗所需自備試驗器材:

    1.酶標(biāo)儀(450nm)

    2.高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

    3.37℃恒溫箱

    4.蒸餾水或去離子水

    樣本處理及要求:

    1. 血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時或4℃過夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

    2. 血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

    3. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

    4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清:請1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

    5. 其它生物標(biāo)本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測。

    6. 樣品外觀:樣品應(yīng)清澈透明,懸浮物應(yīng)離心去除。

    7. 樣品保存:樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測),或-80℃(6個月內(nèi)檢測),避免反復(fù)凍融,標(biāo)本溶血會影響檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

    注意事項:

    1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

    2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

    3. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

    4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

    5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。

    6. 在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。

    7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

    8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

    9. 不能使用過期產(chǎn)品。

    10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

    操作步驟:

    1.從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

    2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。

    3.樣本孔中a加入待測樣本50μL;空白孔不加。

    4.除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

    5.棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。

    6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

    7.每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

    實驗結(jié)果計算:

    繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在Excel工作表中,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。

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    (此圖僅供參考)

    性能:

    1. 檢測范圍:25 pg/mL – 800 pg/mL。

    2.靈敏度:檢測濃度小于1.0 pg/mL。

    3.特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

    4.重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,板間變異系數(shù)小于15% 。

    小鼠谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)試劑盒技術(shù)小提示:

    1. 當(dāng)混合或重溶蛋白溶液時,盡量避免起沫。

    2. 為了避免交叉感染,配置不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品、上樣、加不同試劑都需要更換槍頭。另外不同試劑請分別使用不同的移液槽。

    3. 每次孵育時,請正確使用封板膠可保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    4. 混合后的顯色底物在上板前應(yīng)為無色,請避光保存;假如微孔板后,將由物色變成不同深度的藍(lán)色。

    5. 終止液上板順序應(yīng)同顯色底物上板順序一致;加入終止液后,孔內(nèi)顏色由藍(lán)變黃;若孔內(nèi)有綠色,則表明孔內(nèi)液體未混勻;請充分混合。

    說明:

    1. 由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析,本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。

    2. 實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān),請務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

    3. 不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別,如:檢測限、靈敏度以及顯色時間等,請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行實驗操作,網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。

    4. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果,不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到檢測結(jié)果。

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